[volume. vol.상]----------
제3판 발행에 즈음하여 / 官崎 香 岡田雅人
초판 서론 / 官崎 香 岡田雅人
제1장 단백질 실험의 진행법 / 官崎 香
1-1 기본적인 실험의 흐름 = 12
1-2 단백질 실험 포인트 = 14
제2장 단백질의 기본적인 실험조작
1. Buffer 조제법 / 西望 = 17
1-1 Buffer(완충액)의 선택 = 17
1-2 Buffer의 조제 예 = 19
(1) Phophate buffer(인산 buffer)
(2) Tris buffer
(3) GTA buffer
2. 단백질의 안정화 / 西望 = 24
2-1 단백질의 구조 = 24
2-2 안정화시약 = 26
(1) 단백질을 취급함에 있어서 일반적인 주의사항
(2) 방부제
(3) Protease inhibitor
(4) 다수산기성 화합물
(5) SH기 보호제, 산화방지제
(6) 흡착 방지제
(7) 기타
3. 단백질 정량법 / 奧村宣明 = 30
3-1 UV법(280nm) = 31
3-2 Biuret법 = 32
3-3 Lowry법 = 33
3-4 BCA법 = 33
3-5 Bradford법 = 34
제3장 단백질 추출법
1. 세포의 파괴와 분획 = 35
1-1 동물조직 / 中村正彦 = 37
(1) 원리와 기초지식
(2) 분획의 실제(간장의 적출과 분획)
(3) 세포 소기관의 분리정제
1-2 배양세포 / 官崎 香 = 47
1-3 효모(yeast) / 中井正人 中井由實 = 56
1-4 식물 / 騰田祐一 = 61
2. 단백질의 가용화법 = 65
2-1 생체막성분의 분리 = 65
(1) 핵막의 분리
(2) Mitochondria 막성분의 분리
(3) 세포막의 단리 정제
2-2 막단백질의 가용화 = 69
(1) 막단백질의 존재 양식
(2) 생체막 조성과 막단백질의 안정성
(3) 막단백질의 가용화 방법
제4장 분리정제법
1. 정제의 조립 방법 / 官崎 香 = 75
1-1 정제를 시작하기 전 = 75
(1) 활성 측정
(2) 정제의 목표
(3) 좋은 출발재료의 확보
(4) 단백질의 안정화
1-2 정제의 진행방법 = 76
2. 황산암모늄분획, 농축, 탈염조작 / 官崎 香 = 81
2-1 황산암모늄 분획 = 81
2-2 유기용매와 산에 의한 단백질의 침전 농축 = 83
(1) 아세톤에 의한 단백질의 침전
(2) 삼염화 초산(TCA)에 의한 단백질의 침전
2-3 막농축(한외여과) = 86
2-4 기타 농축법 = 87
2-5 투석 = 88
3. 저압 chromatography의 기본조작 / 官崎 香 ; 越川直彦 = 91
3-1 연질 담체의 종류 = 91
3-2 필요한 장치와 기구 = 92
3-3 실험 조작 = 94
(1) Column에의 담체 충진
(2) Chromatography의 조작
(3) Badge법에 의한 분리
(4) 담체의 보존
4. 중고압액체 chromatography의 기본조작 (FPLC, HPLC등의 이용) / 安光英太郞 = 98
4-1 System에 필요한 기계류 = 98
4-2 조작 = 101
(1) 전개용매의 조제와 탈기
(2) Controller의 초기 설정
(3) System의 MilliQ W에 의한 washing
(4) Column의 system의 조립, washing과 평형화
(5) 용출 gradient의 program 설정방법과 그 program의 개량 방향
(6) 예비적 용출(추출용의 gradient program을 이용한 prerun)
(7) Sample의 조제
(8) Sample 주입과 용출
(9) Peak의 분획과 포집
(10) Column의 세척과 재평형화
(11) Column을 보존 용매로 치환
(12) Column의 제거
(13) System의 MilliQ W에 의한 세척
5. 이온교환 chromatography / 吉川大和 ; 官崎 香 = 117
5-1 이온교환 chromatography의 원리 = 117
5-2 실험조건 = 117
(1) 담체(gel)의 선택
(2) 완충액(buffer)
(3) 시료액
(4) 유속
(5) 용출, column의 보존
5-3 음이온 교환 HPLC의 실험예-Laminin-5(라도신)의 정체 = 122
5-4 연질gel 이온교환 chromatography = 124
5-5 기타 = 125
6. Gel 여과 chromatography / 吉川大和 ; 山中直樹 ; 官崎 香 = 126
6-1 원리와 특징 = 126
6-2 실험조건 = 127
(1) 담체(gel)
(2) 시료
(3) Buffer
(4) 기타
6-3 Sepharose 4B를 이용한 gel 여과 chromatography-라도신(laminin-5) 정제에의 응용 = 129
6-4 Superdex column을 이용한 gel 여과 HPLC = 132
6-5 Gel 여과에 의한 탈염 = 133
7. Affinity chromatography / 越川直彦 ; 官崎 香 = 135
7-1 주요안 실험조건 = 136
(1) Ligand의 선택
(2) Ligand 고정화 담체의 선택과 고정화 방법
(3) 흡착조건
(4) 용출조건
7-2 Affinity chromatography의 실제 = 139
1 Trypsine affinity chromatography
2 Gelatin affinity chromatography
7-3 기타 chromatography = 145
(1) Hydroxyapatide chromatography
(2) 소수(hydrophobic chromatography)
8. 역상 chromatography / 中澤美紀 = 147
8-1 중요한 실험 조건 = 147
8-2 실험 조작 = 148
제5장 유전자 재조합 단백질의 발현과 정제
1. 대장균에 의한 융합 단백질의 발현과 정제 = 141
1-1 His tag 단백질의 발현과 정제 / 安光英太郞 ; 和久井世紀 = 153
(1) 실험의 개요와 예비실험
(2) 대장균의 파괴와 단백질의 추출
(3) His tag 단백질의 용해
(4) His-tag 단백질의 Nickel column으로부터 용출
(5) Nickel column의 재생과 보존
(6) 단백질 정제를 성공시키기 위한 중요 포인트
1-2 GST 융합단백질의 발현과 정제 / 光英太郞 = 173
1-3 봉입체로부터의 활성재생법 / 三澤 悟 = 178
(1) 실험예 1 : 조직 Plasminogen 활성인자(t-PA)의 활성 재생법
(2) 실험예 2 : Metalloprotease의 저해인자(TIMP)의 활성 재생법
1-4 기타 tag와 융합 단백질 / 安光英太郞 = 192
2. baculovirusㆍ곤충 세포계에서의 재조합 단백질의 발현과 정제 / 川本 進 官城洋平 = 194
2-1 재조합 virus의 제작 = 196
(1) homologous recombinantion을 이용하는 계
(2) Transposition을 이용하는 계
2-2 재조합 단백질의 발현 정제 = 203
3. 동물세포에서의 유전자 재조합 단백질의 발현 / 예谷慶喜 = 206
3-1 발현계의 설계 = 206
3-2 결론 = 213
4. 무세포 단백질의 합성계 / 淸水義宏 上田卓也 = 214
4-1 무세포 단백질 합성계의 개요와 그 이점 = 214
4-2 PURESYSTEM kit을 이용한 단백질의 합성 = 215
5. 고차구조 해석을 위한 단백질의 조제 = 222
5-1 X선결정구조 해석을 위한 단백질 조제법 / 山下瑩樹 = 222
(1) 정제의 순도
(2) 완충액
(3) 안정성
(4) 검정법
5 필요한 양
6 결정화의 방법
5-2 NMR 해석을 위한 단백질 조제법 / 池上貴久 = 226
(1) 안정동위체 도입을 위한 단백질 발현법
(2) NMR sample의 최종 조제
찾아보기 = 234
하권 찾아보기 = 238
[volume. vol.하]----------
목차
제1장 단백질의 분리동정에서 기능해석까지 / 岡田雅人 = 12
1-1 단백질 분리동정의 진행방법 = 12
1-2 단백질 기능해석을 향해서 = 15
(1) 항체를 이용한 단백질의 분리와 검출
(2) 단백질의 번역 후 수절의 해석
(3) 단백질 상호작용의 해석
1-3 끝으로 = 16
제2장 전기 영동법에 의한 단백질의 분리
1. Polyacrylamide gel 전기영동 = 17
1-1 SDS-polyacrylamide gel 전기영동(SDS-PAGE) / 奧村宣明 = 17
1-2 단백질의 염색 / 奧村宣明 = 24
(1) CBB 염색
(2) 은염색
(3) SYPRO Ruby 염색
(4) SDS-PAGE로부터 단백질 회수
1-3 기타 전기 영동법 / 奧村宣明 = 30
1-4 SDS-PAGE에 의한 단백질의 정제법 / 赤莢辛太郞 ; 官崎 香 = 32
(1) 확산법에 의한 추출법
(2) 전기영동 용출법
(3) 조제용 전기 영동 장치
2. Western Blotting / 奧村宣明 = 40
2-1 단백질의 membrane에로의 전사와 Ponceau S 염색 = 41
2-2 항체와의 반응과 항원의 검출 = 44
(1) Bloking과 항체와의 반응
(2) HRP반응에 의한 항원의 검출-DAB법
(3) HRP반응에 의한 항원의 검출-화학발광법
(4) Alkaline phosphotate 반응에 의한 항원의 검출
2-3 Band의 정량 = 49
(1) Scanner 또는 CCD 카메라를 이용한 방법
(2) 화학발광검출용의 고감도 CCD 카메라를 이용한 방법
(3) $${}^{125}$$I를 이용한 방법
(4) Radioimmunoassay
3. Peptide Mapping = 52
3-1 SDS-PAGE상에서의 일차원 mapping / 佐佐英德 = 52
(1) Protease(cleveland mapping)
(2) CNBr 분해
3-2 TLC상에서의 2차원 Mapping / 柳茂 = 58
(1) 세포의 표식
(2) 면역침강ㆍ전기영동ㆍ막에의 전사
(3) Trypsine digest에 의한 인산화 peptide map
제3장 단백질의 동정법
1. Proteome 해석 = 68
1-1 서론 / 岩松明彦 = 68
1-2 해석의 진행방법 / 岩松明彦 = 68
1-3 Immobiline을 이용한 2차원 전기 영동법 (1차원째 조작방법을 중심으로) / 폐谷 誠 = 71
(1) 1차원째 : 등전점 전기영동
(2) 2차원째 : SDS-PAGE
(3) 단백질의 염색법, 해석법
1-4 일차 구조해석을 위한 blotting법 / 岩松明彦 = 81
1-5 PMF 해석샐행에 맞는 선택 / 岩松明彦 = 84
1-6 PVDF막위의 단백질의 환원 S-alkyl화와 protease의 digestion / 岩松明彦 = 85
1-7 질량분석과 Peptide mass fingerprinting (PMF)법에 의한 단백질 동정 / 岩松明彦 = 89
2. 아미노산 배열결정법 / 一ノ瀨幸代 大森 彬
2-1 분석을 위한 시료의 조제 = 98
(1) SDS-PAGE의 band 혹은 이차원 전기영동 겔의 Spot의 N 말단 분석법
(2) SDS-PAGE 혹은 이차원 전기영동법으로 분리한 단백질 Spot의 내부 배열분석
(3) SDS-PAGE 혹은 이차원 전기영동법으로 분리한 단백질 Spot의 고감도clevedland법에 대하여
2-2 시료의 탈염, 농축법 = 105
(1) 단백질 혼합물의 농축법
2-3 Protein Sequencer에 의한 아미노산 배열분석 = 108
2-4 아미노산에 따른 분석상의 문제점 = 109
제4장 항체를 이용한 단백질의 분리와 검출
1. 항체 column에 의한 단백질의 정제 / 宮崎 香 廣崎智巳
1-1. 실험조작의 개략 = 113
(1) 항체
(2) 항체 column
(3) 항원 단백질의 정제
1-2 항체 column의 제작 = 114
1-3 항체 affinity chromatography의 조작법
항 laminin α 3 monoclonal 항체 column을 이용한 laminin 5(ladosine)의 정제 = 117
2. 면역침강법 / 小阪智博 東 昌市
2-1 일반적 방법과 원리 = 120
(1) Monoclonal 항체를 이용할 경우
(2) Polyclonal 항체를 이용할 경우
(3) 항원-항체반응의 조건
4 용출조건
2-2 면역 침강법을 이용한 세포막 표층 단백질의 검출
대장암 세포에 있어서 세포표층의 E-cadherin의 검출 = 122
3. 면역 염색법 / 森山佳谷乃
3-1 주요한 실험조건 = 127
(1) 검출법의 선택
(2) 항체의 선택
(3) 표본의 제작
(4) 기타
3-2 Formalin 고정ㆍParaffin 절편의 염색 = 130
3-3 배양세포를 이용한 염색 = 135
(1) 접착배양세포의 형광 염색
(2) 부유 세포의 경우
제5장 수절단백질의 해석
1. 인산화 단백질 / 岡田雅人
1-1 인산화 단백질의 검출 = 142
(1) 항체를 이용한 인산화 검출법
(2) 항 인산화 Tyrosine 항체를 이용한 western blotting
(3) 간접적인 인산화 검출법
(4) Radioisotope(R)를 이용한 인산화 검출법
1-2 인산화 이미노산의 분석 = 152
1-3 인산화 부위의 동정법 = 156
(1) 부위특이적 변이체를 이용한 해석
(2) Peptide mapping법
(3) 질량분석에 의한 해석
4 아미노산 Sequencer를 이용한 방법
2. 당쇄 / 米田敦子 松本勳武
2-1 렉틴을 이용한 해석 = 159
2-2 당쇄의 절단 = 161
2-3 당쇄의 구조해석 = 162
(1) 단당조성 분석
(2) Pyridylamino화
(3) HPLC 분석
4 당쇄구조 해석
부록
1. 유용한 internet site의 소개 = 168
2. 주요한 시약의 분자량 = 171
3. 단백질 분자량 조건표 = 171
찾아보기 = 172